摘要: 对溶菌酶的稳定性的改善、制备、基因工程表达产物的复性处理作了介绍, 并且对溶菌酶在医药、食品工业和生物工程上的应用作了概述。
关键词: 溶菌酶; 稳定性; 制备; 应用
华南理工大学生物工程系：吴晓英, 林 影, 陈慧英
工业微生物（Industrial Microbiology）2002年12月

溶菌酶( lysozyme) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 又称胞壁质酶( muram-i dase) 。人们对溶菌酶的研究始于上世纪初, 英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6 年( 1922 年) 发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶, 因其具有溶菌作用, 故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌物, 某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。其中鸡蛋清溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛。另外随着基因工程技术的发展, 通过人工合成基因, 用微生物发酵生产人溶菌酶的研究也正在深入进行之中。下面就溶菌酶的结构、性质与稳定性的改善、提取、生产以及应用方面的研究进展作一综述。

1 溶菌酶的结构、性质与稳定性改善

蛋清溶菌酶是由129 个氨基酸残基组成的碱性球蛋白。单一肽链, 分子量为14388, 分子内含有四对二硫键。

溶菌酶的活性中心为Asp52 和Glu35。它能催化水解N- 乙酰葡萄糖胺和N- 乙酰胞壁酸之间以及N- 乙酰葡萄糖胺之间的B- 1, 4 糖苷键。

溶菌酶是一种比较稳定的蛋白质, 通过下列措施可以进一步改善溶菌酶的热稳定性:

1. 1 增加二硫键可以增加溶菌酶的热稳定性

Wetzel用蛋白质工程技术为T4 溶菌酶增加了二硫键, 提高了该酶的热稳定性。

1. 2 六环水可以提高溶菌酶的热稳定性

赵林等的研究表明, 水经低温超声定频谱振后, 大多数呈六环和六笼形水分子簇存在, 这种水在生物蛋白、核酸、细胞及组织活动中起到重要作用。经DSC 法实验证明, 用六环水合溶菌酶时, 每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数258 个增加了150 个, 达到408 个, 相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6 个水分子, 这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六笼形的动态氢键网络, 这种六笼形机构具有最为稳定的结构能。结构水物化特性的改变有助于溶菌酶中疏水相互作用力的加强, 溶菌酶周围有序的结合水量和水化层强度增加, 从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力, 因此增强了溶菌酶的稳定性。

1. 3 定点突变改变溶菌酶的稳定性

项明的研究表明溶菌酶的定点突变改变了蛋白质中共价连接, 取代的氨基酸残基不涉及能形成二硫键的半胱氨酸, 故取代残基侧链在疏水性及体积的差异必然对溶菌酶的空间结构的形成产生扰动, 进而影响其稳定性, 以此出发从其实验结果中发现一个有趣的趋势, 与野生型溶菌酶比较, 热力学稳定性自由能变化提高的突变体有两类, 一类为非极性侧链氨基酸取代极性侧链氨基酸, 如D101A; 另一类是体积较大的非极性氨基酸取代体积较小的非极性氨基酸, 如A31V、TIT, 同分异构体氨基酸取代则热力学稳定性变化不大; 反之热力学稳定性自由能变化较低的定点突变体中, 则可见相反的情况。简单地说, 即体积大的疏水侧链有利于溶菌酶稳定性的提高。

Song 等在鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白产生突变体I55T 和D66H 的基础上, 应用定点突变构建了具有在49 位用门冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信号序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉样蛋白生产突变体( I55TPG49N, D66HPG49N) , 这些糖基化突变体比非糖基化突变体在酵母表达系统S . cerevisiae 的分泌大大增加, 糖基化突变体在37 e 、pH7. 4 条件下, 仍保持40% 的酶活性, 而非糖基化突变体在同样条件下最后失去全部活性, 说明糖基化链能掩蔽淀粉样蛋白生产的溶菌酶分子的B- 折叠, 增加了淀粉样蛋白生产的溶菌酶的稳定性。

2 溶菌酶的制备

2. 1 天然资源的溶菌酶的制备

2. 1. 1 鸡蛋清溶菌酶的制备

鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3. 5% , 是提取溶菌酶的方便来源。但不同产地的鸡蛋, 其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤与亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。郇延军采用控制温度、调酸和加盐的分离纯化工艺将溶菌酶分离, 之后利用超滤和喷雾干燥方法制成产品, 产品活力达11000u/mg。

利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。Sternberg 等1974 年报道了应用聚丙烯酸( PAA) 形成PAA ) 溶菌酶聚电解质复合物。Chern 等于1996 年应用pH 敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100 作为溶菌酶的沉淀剂。最近Vaidya 等报道采用N - 异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶, 得到90% 的收率。他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH 敏感聚合物具有更多的优点, 因为后者通常只有较低的收率。

Owen 等1997 年报道使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶, 该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题, 诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。

另外最近Ghosh 等报道采用小型的中空纤维超滤系统( 30kDa MWCO, 聚砜膜) 从蛋清干粉中分离溶菌酶。溶菌酶被选择性透过膜, 而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留。改进系统的流体动力学导致溶菌酶透过的增加, 从而获得较好的收率。

2. 1. 2 萝卜溶菌酶的制备

国内有人在对华南地区50 多科120 多种植物进行普查中, 发现十字花科萝卜叶中溶菌酶含量最高, 且发现萝卜溶菌酶的耐热性、耐酸性均优于鸡蛋清溶菌酶。进一步研究发现, 该酶的抑菌效果与现在普遍生产和应用的鸡蛋清溶菌酶有所不同。该酶不但对白色葡萄球菌等3 种格兰氏阳性菌, 而且对大肠杆菌等6 种格兰氏阴性菌及酵母、毛霉等5 种真菌具有不同程度的抑制作用, 对另外参试的白菜软腐病等7 种植物病原细菌、真菌及烟虫和小菜蛾两种昆虫都有抑杀作用。萝卜溶菌酶抑菌的广谱性和较强的抑菌能力, 以及原料成本低廉, 都为萝卜溶菌酶提供了良好的应用前景。卢顺舵等以脱氨几丁质为亲和吸附剂, 直接从萝卜叶的抽提液中制备溶菌酶, 产品比活力达42162u/mg。

2. 1. 3 马奶溶菌酶的制备

岳克等将蒙古马奶经过硫酸铵沉淀, 乳清蛋白脱盐, DEAE - Sephadex A - 25, Sephadex G- 100,CM- Sephadex C- 25 柱层析分离得到马奶溶菌酶,产率为38mgPL 马奶。

2. 2 利用基因工程技术制备溶菌酶

崔晓江等以噬菌体T7DNA 为模板, PCR 扩增T7 溶菌酶基因, 插入pBluescript SK 载体。DNA 序列分析表明, 克隆的T7 溶菌酶基因和已报道的序列无氨基酸水平上的差异。将T7 溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白( PR1b) 信号肽编码序列的3.末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白( PLRV CP) 基因靠近3. 末端处, 构建成两个融合蛋白基因。将T7 溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体pBV221, 实现T7 溶菌酶基因在大肠杆菌中的高效表达, 其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的20% 以上。

钱世均等构建了人溶菌酶工程菌JPB- HLY,E. coli 工程菌得高效表达, 经培养、诱导, 所得菌体经破碎, 酶蛋白的变性、复性处理, 酶活力测定结果为30000uPL 培养液。他们通过对含人溶菌酶的包含体的分离、溶解、、多肽复性方法等研究, 来提高酶的复性率。结果表明: ( 1) 用有机溶剂处理菌体, 同样能使含人溶菌酶的包含体从细胞中释放出来, 特别是在丙酮处理后, 经变性复性所得酶活性还高出超声处理后的酶活性12% ; ( 2) 在复性时, 加入分子量8000, 20000 的PEG 都能提高酶的复性率( 分别提高22% 和17% ) ; ( 3) 在复性液中, 加入氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽之比在2: 1 时, 酶的复性效果最好; ( 4) 一定浓度的甘油对酶的复性也有帮助, 5%和10% 的甘油能提高酶的复性率的31. 4%和36. 5%。

要提高重组蛋白质的复性率, 最近的研究是利用分子伴侣促进蛋白质的复性。董晓燕等利用重组大肠杆菌表达制备了分子伴侣GroE( GroEL 和Gro-ES) , 研究了GroE 以及GroEL 辅助变性溶菌酶复性的作用。结果表明, 不仅游离GroEL 单独作用可使溶菌酶复性收率达到90% 以上, 而且固定化GroEL亦可有效地促进蛋白质复性, 最佳复性温度为37 e , 最佳pH 值范围为6- 8, 复性酶的活性收率在85% 以上。另外, 固定化GroEL 可反复回收利用, 表明固定化GroEL 有可能应用于生物下游的蛋白质复性过程。

3 溶菌酶的应用

溶菌酶在医药、食品防腐和生物工程中应用非常广泛。

3. 1 在医疗中的应用

溶菌酶是一种糖苷键水解酶, 具抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用, 临床上常用于五官科各种炎症、扁平疣、传染性软疣、寻常性疣等各种皮肤病的治疗, 还可用于预防和治疗病毒性肝炎, 尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。另外, 人体溶菌酶还可作为多种疾病的诊断指标。

3. 2 在食品工业中的应用

溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质, 又具有一定的溶菌作用, 因此可用作食品防腐剂。已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐, 还可以添入乳粉中, 使牛乳人乳化, 以抑制肠道中腐败微生物的生存, 同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外, 还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。

章银良利用溶菌酶对草莓进行保鲜, 结果表明: 在20 e , 溶菌酶0. 07%、氯化钙0. 5%、甘氨酸1.5%、pH7 的条件下, 保鲜效果最好。

3. 3 在生物工程中的应用

溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能, 以此酶处理格兰氏阳性细菌得到原生质体, 因此溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。国外多用于菌体内容物质的提取。只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理, 再结合使用超声波、冷冻离心等手段, 就可得到无细胞提取液, 进一步精制, 可得到所需的菌体物质。因此生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求量将与日俱增。（参考文献略）